CINETICA MICROBIANA

CINETICA MICROBIANA

En microbiología la palabra crecimiento se define como un incremento en el numero de células. El crecimiento es un componente esencial de la función microbiana ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la población.

Fisión binaria

En la mayoria de los procariontes, el crecimiento de una celula individual continua hasta que se divide en dos celulas nuevas un proceso que se denomina fisión binaria. En un cultivo en crecimiento de un bacilo como por ejemplo Escherichia coli, se observa que las celulas se alargan hasta aproximadamente el doble de la longitud de la celula pequeña y luego forma un tabique que acaba por separar la celula en dos celulas hijas. Este tabique se conoce como septo y es el resultado del crecimiento hacia dentro de la membrana citoplasmática y pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos celulas hijas se separan.

Todos los constituyentes celulares aumentan de modo que cada celula hija recibe un cromosoma completo y suficientes copias de todas las moléculas, monomeros e iones inorgánicos, como para existir como ceula independiente. El reparto del DNA replicado entre las dos celulas hijas depende de la union del DNA a la membrana durante la división y la segregación real de las dos copias es facilitada por la formación del septo.

Proteinas Fts y el plano de la división celular.

Se han identificado varias proteinas importantes en el proceso de la división celular de los procariotas, estas proteinas son esenciales para la división celular normal y se han llamado proteinas Fts.

Las proteinas Fts forman en la celula un aparato de división que se llama divosoma, cuya formación comienza con la union de moléculas de FtsZ formando un anillo alrededor del cilindro celular hacia el centro de la celula. Esta area define el plano de división celular, las moléculas de FtsZ polimerizan hasta formar un anillo continuo que luego atrae a otras proteinas FtsZ.

La replicación del DNA ocurre antes de que se forme el anillo de FtsZ. El cese de la síntesis de DNA parece ser la señal para la formacio del anillo y esta estructura aparece precisamente en es espacio situado entre los dos nucleoides duplicados. En cualquier caso a medida que progresa la elongación celular las dos copias del cromosoma se separan y cada uno termina en una celula hija. Cuando ocurre la contrición, el anillo de FtsZ comienza a despolimerizarse y se dispara hacia el interior decesa zona la síntesis de los materiales de la pared celular que eventualmente llega a sellar la region de union de una celula con otra.

Crecimiento de poblaciones

La velocidad del crecimiento es el cambio en el numero de celulas o en la masa celular experimentando por unidad de tiempo. Durante el ciclo de división celualar todos los componentes estructurales de la celula se duplican. El intervalo para la formación de dos celulas apartir de una supone de una generación, el tiempo de generación.

El tiempo de generación es el tiempo que se requiere para que la población se duplique razon por la cual a veces el tiempo de generación se llama tiempo de duplicación.

Muchas bacterias tienen tiempos de generación comprendidos entre 1 – 3 horas, pero unas cuantas crecen muy rapidamente y se dividen en tan solo 10 minutos mientras que otras tardan varios dias. El tiempo de generación de un microorganismo determinado tambien es funcion del medio de cultivo utilizado y de las condiciones de incubación empleadas.

Parámetros del crecimiento (Expresión matemática del crecimiento)

El aumento en numero de celulas que se produce en un cultivo bacteriano creciendo exponencialmente es una progresión geométrica de base 2. Cuando dos celulas se dividen se convierte en cuatro y esto se puede expresar como 2¹--2² . Cuando cuatro celulas pasan a ocho lo expresamos como 2²---2³ y así sucesivamente.

Debido a esta progresión geométrica, existe una relacion directa entre el numero de celulas presentes inicialmente en el cultivo y el numero presente tras un periodo de crecimiento exponencial:

N=No2ⁿ

Donde N = numero final de celulas, No= numero inicial de celulas y n = al numero de generaciones que han ocurrido durante el periodo de crecimiento exponencial. El tiempo de generación g, de la población celular se calcula como t/n, donde t indica simplemente las horas o minutos de crecimiento exponencial. Por lo tanto sabiendo el numero inicial y final de celulas en una población que esta creciendo exponencialmente, es posibla alcular n; y conociendo n y t, calcular el tiempo de generación g.

Para expresar n a partir de la ecuación N=No2ⁿ se necesita hacer las siguientes transformaciones:

N=No2ⁿ

logN = log No + n log 2

log N- log No = n log 2

n= logN – log No = logN – log No

log 2 0.301

= 3.3 (log N – log No)

expresando n funcion de terminos fácilmente medibles como N y No, se pueden calcular los tiempos de generación.

Otro indice de la velocidad de crecimiento es la constante de la velocidad de crecimiento, abreviadamente k. La constante de la velocidad de crecimiento se expresa como constante de la velocidad de crecimiento se expresa como

k= In2 = 0.693

g g

y tienen unidades de hora ^–1. Mientras que g es una medida del tiempo que tarda una población en duplicar su numero de celulas, k es una medida del numero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo en un cultivo exponencial.

Curva de crecimiento

En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado tambien conocido como cultivo monofasico se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva de crecimiento puede dividirse en distintas fases llamadas fases de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.

Fase de latencia

Cuando se inocula una población microbiana en un medio fresco, por lo general el crecimiento no comienza inmediatamente sino solo tras un periodo de tiempo que constituye la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo y de las condiciones de crecimiento. Si un cultivo exponencial se inocula en el mismo medio y en las mismas condiciones de cultivo, no se observa un retraso y el crecimiento exponencial se inicia inmediatamente. Si el inoculo se toma de un cultivo viejo y se inocula en el mismo medio, se observa normalmente un retraso aunque todas las celulas del inoculo sean viables, es decir sean capaces de reproducirse. Esto se debe con frecuencia a que las celulas carecen de varios componentes esenciales para dividirse y se requiere tiempo para su síntesis. Tambien se aprecia un retraso cuando las celulas del inoculo han sido dañadas parcialmente con calor, radiaciones o compuestos toxicos, debido al tiempo requerido para recuperarse y reparar los daños.

La fase de latencia tambien ocurre cuando se transfiere una población de un medio rico a otro medio mas pobre. Para que ocurra crecimiento en un medio de cultivo particular las celulas deben tener un equipo enzimatico completo que permita la síntesis de los metabolitos esenciales ausentes en el medio. Al pasar a otro medio se necesita tiempo para la síntesis de las nuevas enzimas.

Fase exponencial

La fase exponencial de crecimiento es una consecuencia del hecho de que cada celula se divide para formar dos, cada una de las cuales va a formar otras y asi sucesivamente. Las celulas en crecimiento exponencial estan en el estado fisiológico mas sano, las celulas tomadas en el punto medio del crecimiento exponencial son a menudo las mas indicadas para estudios enzimaticos y estructurales.

La velocidad de crecimiento esta influenciada por las condiciones ambientales y las características geneticas del organismo. Por lo general los microorganismos procariontes crecen mas rapido que los eucariontes y los eucariontes de tamaño pequeño lo hacen mas rapido que los de mayor tamaño.

Fase estacionaria

Es un sistema de cultivo cerrado en medio o renovado o monofasico. Lo que realmente susede es que:

1. un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser factor limitante del crecimiento.
2. se acumula en el medio algunos productos de desecho hasta niveles inhibitorios que hacen que cese el crecimiento exponencial.

Frecuentemente ocurren ambas cosas, al producir esto la población alcanza la fase estacionaria.

En la fase estacionaria no hay aumento ni descenso neto en el numero de celulas. Aunque no suele haber crecimiento en la fase estacionaria muhas funciones celulares continuan, como el metabolismo energético y algunos procesos biosinteticos.

Fase de muerte

Si la incubación continua después de que la población haya alcanzado la fase estacionaria las celulas pueden continuar vivas y metabolicamente activas, pero tambien pueden morir, si ocurre esto ultimo se dice que la población esta en fase de muerte.

Medicion y eficacia del crecimiento

Recuento de todas las celulas

El numero de celulas de una población se puede determinar contando una muestra con el microscopio mediante metodos de recuento directo. El recuento directo se puede hacer de dos formas, en muestras secas sobre portas o en muestas liquidas. Con muestras liquidas se emplean camaras de recuento especiales.

En el microscopio se pueden contar el numero de celulas por cada unidad de area de la parrilla, lo que permite conocer el numero de celulas por el volumen que determina cada area. La conversión de este valor a numero de celulas por mililitro de la suspensión original se hace fácilmente multiplicando por un factor de conversión que depende del volumen del tipo de camara.

El recuento directo por microscopia es un metodo rapido para conocer el numero de celulas. Sin embargo presenta ciertas limitaciones:

1. no distingue las celulas vivas de las muertas
2. las celulas pequeñas son difíciles de ver con el microscopio y algunas posiblemente se pierden en el recuento.
3. en ocasiones la presicion es difícil
4. se requiere un microscopio de contraste de fases cuando las muestras no se tiñen
5. el metodo no sule ser adecuado para suspensiones con baja densidad celular
6. las celulas moviles se deven inmovilizar antes del recuento.

Recuento de las celulas viables

En muchos casos interesa contar solo las celulas vivas y con este fin se han desarrolado metodos de recuento de celulas viables. Una celula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia y el metodo usul para realizar una determinación de celulas viables se basa en contar el numero de celulas de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio solido adecuado. El recuento de celulas viable tambien se llama recuento en placa o recuento de colonias. En este procedimiento se supone que cada celula viable puede formar una colonia.

Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para viables:

El metodo de extensión en placa: un cierto volumen de cultivo diluido que no suele ser superior a 0.1 ml se extiende sobre la superficie de una placa con medio solido utilizando una asa esteril de extensión. La placa se incuba después hasta que aparece las colonias y se cunta su numero.

El metodo del vertido en placa: se pipetea un volumen conocido decultivo en una placa de petri esteril sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla todo bien con suaves movimientos de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar que solidifique. Como la muestra se mezcla con el medio fundido se puede usar volúmenes de inoculo mayores que en el metodo de recuento por extensión; sin embargo con este metodo el organismo que se cuenta debe ser capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45ºC.

Medidas directas del crecimiento microbiano: turbidez

Un metodo muy rapido y util para obtener estimaciones del numero de celulas son las medidas de turbidez. Una suspensión celular aparece turbia a la vista porque las celulas dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas mas celulas esten presentes mayor sera la luz dispersada y por lo tanto mayor la turbidez.

La turbidez puede medirse con aparatos como el fotómetro o espectropfotometro aque hacen pasar la luz atravez de suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no dispersada.

Las longitudes de onda mas comúnmente usadas para medir la turbidez bacteiana son 540 nm (verde), 600 nm (naranja) y 660nm (rojo).

Cultivo continuo: el quimiostato

Un cultivo continuo es un sistema abiero con volumen constante al que se añade continuamente medio fresco y del que se retira continuamente medio usado con celulas a una velocidad constante. Una vez que se alcanza el equilibrio en el sistema, el numero de celulas y el estado metabolico permanecen constantes y se dice entonces que el sistema esta en estado de equilibrio.

El quimiostato

El tipo mas comun de aparato que se utiliza para obtener un cultivo continuo es el quimiostato, que controla tanto la densidad de la población celular como la velocidad de dilución y la concentración de nutrientes que actua como factor limitante, tal como la fuente de carbono o de nitrogeno.

En el quimiostato la velocidad del crecimiento y la producción de celulas pueden controlarse independientemente una de la otra; la primera ajustando la velocidad de dilución y la segunda variando la concentración de un nutriente que actua como factor limitante.

En el quimiostato la densidad celular (celulas/ml) se controla por el nivel del nutriente que actua como factor limitante.

Si se eleva la concentración de este nutriente en el medio entrantre manteniendo constante la velocidad de dilución la densidad celular aumentara. Por tanto manipulando la velocidad de dilución y el nivel de nutrientes, el experimentador puede obtener a voluntad una gran variedad de densidades de población celular creciendo a distintas velocidades de crecimiento.